Ben Stiller už sice místo nočního hlídače v muzeu opustil a stal se úspěšným vynálezcem, přesto se mu po zážitcích s oživlými šelmami, neandertálci a indiány stále stýská. Vhodnou záminku k návratu najde ve chvíli, kdy mu zavolá jeden z nestorů muzeální sbírky, maličký kovboj alias Owen Wilson, a vysvětlí mu, že muzeum ohrožené zánikem potřebuje pomoc.
Exponáty, mezi nimiž si Stillerův hrdina našel kamarády, se už zdají zastaralé, takže jednotlivé kusy sbírky čekají v bednách na přepravu do ohromných depozitářů v největším muzeu světa, ve washingtonském Smithsonianu.
Jenže od nejistoty není daleko ke vzpouře, zvláště když se po třech tisíciletích probudí ze spánku nevrlý egyptský vládce, kterého si zahrál Hank Azaria. Utvoří velitelský štáb se svými věhlasnými kolegy: ruským carem Ivanem Hrozným, jejž ztvárnil Christopher Guest, s francouzským císařem a vojevůdcem Napoleonem Bonapartem neboli Alainem Chabatem a s americkým mafiánem Al Caponem, jehož ztělesnil Jon Bernthal.
Společně zmobilizují další přívržence a plánují převrat, při kterém hodlají ovládnout nejdříve muzeum Smithsonian a postupně pak celý svět. Hrdina při své washingtonské záchranné misi najde vedle starých dobrých známých, k nimž náležejí Robin Williams coby americký prezident Roosevelt či Patrick Gallagher jako vůdce bojovných Hunů Atilla, i několik nových přátel.
Jmenovitě vědce Alberta Einsteina, prezidenta Abrahama Lincolna a nezkrotnou krásku, kterou představuje Amy Adamsová. Na to, aby obnovili klid a pořádek, mají ve finále jedinou pohádkovou noc.
Noc v muzeu 2 je vůbec prvním filmem v historii, který se točil přímo v komplexu muzea Smithsonian. Nacházejí se v něm i slavná umělecká díla jako Rodinova socha Myslitel či objekty popkultury včetně Darth Vadera z Hvězdných válek. Rozpočet filmu činil sto padesát milionů dolarů a premiéra od 20. do 22. května zahrne na 35 zemí světa.
